Portada » MODIFICACIÓN GENÉTICA DE CÉLULAS

MODIFICACIÓN GENÉTICA DE CÉLULAS

Precedentes

Las enfermedades autoinmunes o el rechazo a trasplantes son fenómenos mediados por el sistema inmunitario. Se estima que uno de cada cuatro españoles sufre o sufrirá a lo largo de su vida alguna de las enfermedades autoinmunes. En cuanto a los trasplantes, cerca de un 50% de todos los órganos trasplantados son rechazados en un periodo de 10 a 12 años, además de que existen complicaciones durante todo el proceso que pueden poner en peligro la viabilidad del órgano trasplantado y la vida del paciente. En estos fenómenos, las células del sistema inmunitario atacan al propio organismo o a las células del órgano trasplantado.  Y es que, aunque existen muchos tipos de enfermedades autoinmunes u órganos trasplantados, la patogénesis de estos fenómenos presenta, como elemento común, una respuesta inmune errónea frente a las células sanas del propio paciente, o del órgano trasplantado, y que puede acompañarse de una activación inmune continua que cronifica y perpetúan el daño. Esta respuesta conduce al desarrollo de la enfermedad autoinmune o el fracaso, y necesario remplazo, del órgano trasplantado.

Este elemento común implica que la respuesta autoinmune, al igual que el rechazo al injerto, podría ser, en teoría, frenada o, incluso, neutralizada, si se controlaran adecuadamente la respuesta inmune efectora y se restableciera la tolerancia inmunológica. Actualmente, para frenar la aparición o progresión de ambas patologías, a los pacientes afectados se les administran fármacos inmunosupresores. Estos fármacos, aunque parcialmente eficaces, nunca llegan a frenar el avance progresivo de la enfermedad y producen marcados efectos secundarios a largo plazo, al producir un estado de inmunosupresión generalizado en el paciente, aumentándoles la susceptibilidad a infecciones, desarrollo de tumores e incluso a otros procesos autoinmunes.

Uno de los factores que juega un papel crucial tanto en el rechazo del órgano, en las enfermedades autoinmunes y en la enfermedad de Injerto contra receptor (GvHD, por sus siglas en inglés) son las células T reguladoras (Treg), debido a su importancia en la homeostasis general del sistema inmune. Estas Treg son una subpoblación de células T CD4+ especializada en el mantenimiento y la recuperación de la homeostasis inmunológica gracias a su capacidad supresora de los procesos inflamatorios. Esta función de las Treg está relacionada con la expresión del factor de transcripción Foxp3, que las distingue como un linaje de células T diferente de las células T convencionales. Y es que estas células son capaces de suprimir la función efectora de células T CD4+ y CD8+ activadas, así como la función de células natural killer (NK), células B, macrófagos, osteoclastos y células dendríticas. Al tener efecto sobre tantos tipos celulares, las Treg son elementos indispensables para el mantenimiento de la homeostasis y la tolerancia inmunológica, ya que un mal funcionamiento o un descenso en su número produce una gran desregulación del sistema inmune, que no puede ser compensada por otro tipo celular.

De forma semejante a otros tipos de células T, las células Treg requieren de una activación a través de su receptor de célula T (TCR) y de señales co-estimuladoras para ejercer su función reguladora. Ex vivo, es decir, en el laboratorio, se puede activar a las Treg de dos formas diferentes, dando lugar a Treg con distintas propiedades. Si se estimulan sólo mediante su TCR y señales de co-estimulo, dará lugar a Treg policlonales no específicas de un antígeno (Ag) diana. Por el contrario, si junto a esas señales de estimulación, se les proporciona la señal de un Ag diana, serán Treg Ag-específicas.

Resultados recientes han demostrado que las células Treg Ag-específicas son más eficaces que las Treg policlonales no específicas la prevención de rechazo de órganos o en diferentes enfermedades.

Para obtener estas Treg Ag-específicas, hasta ahora se debía co-cultivar las Treg junto con células presentadoras del antígeno, como las células dendríticas o células B, emulando lo que ocurre naturalmente en un organismo. La limitación principal de estas estrategias es la mínima cantidad de células obtenidas.

El uso de la tecnología de receptor de antígeno quimérico (CAR, por sus siglas en inglés) superara todas estas limitaciones. Este nuevo método modifica genéticamente linfocitos T para que expresen el CAR.

Este CAR es una proteína diseñada con para reconocer específicamente un Ag y, tras su reconocimiento, proporcionar señales de activación y de co-estimulación a la célula T que lo porta. Un ejemplo de la revolución que supone esta tecnología son las CAR-T diseñadas para reconocer el marcador CD19 en células B tumorales y que presenta una eficacia sin precedentes en el tratamiento de las neoplasias malignas de células B, consiguiendo tasas de hasta el 90% de remisión completa.

El éxito de estas terapias nos ha servido de inspiración para extender la estrategia CAR-T a las células Treg. A diferencia de las CAR-T, las CAR-Treg están dirigidas a suprimir específicamente la activación y expansión de células inmunes implicadas en las enfermedades autoinmunes, en el rechazo a trasplantes o en GvHD.

Recientemente, CAR-Treg alo-específicas dirigidas contra la molécula HLA-A2 de clase I han demostrado tener una actividad supresora específica en modelos de trasplante xenogénicos en ratón, y evitaron completamente el rechazo de células y tejidos alogénicos en ratones en ausencia de inmunosupresión.

Por tanto, hay evidencias de que estas CAR-Treg modificadas genéticamente tienen un gran potencial para el desarrollo de inmunoterapias. Sin embargo, una de las mayores dificultades a las que se enfrenta esta estrategia es que la cantidad de Treg que puede obtenerse a partir de sangre periférica (entre el 2-5% del total de linfocitos T-CD4+).

Para poder usarlas como inmunoterapia, es necesario expandir ex vivo esta poca cantidad de Treg purificadas de sangre periférica. Esto produce una marcada disminución en la estabilidad de la expresión de Foxp3 y en su capacidad supresora. Estos dos factores limitan en gran medida la factibilidad y la eficacia de estrategia terapéutica.

En esta línea de investigación aprovechamos el conocimiento generado por el grupo LIR combinando el uso de las thyTreg, y las múltiples ventajas que eso implica, con los beneficios de conferir especificidad antigénica mediante el CAR a las células Treg.

¿En qué consiste el proyecto?

En el LIR, hemos desarrollado el proyecto pionero que permite obtener células Treg derivadas de tejido tímico (thyTreg) como alternativa a las Treg obtenidas de sangre periférica.

El timo es un tejido que es habitualmente descartado durante la cirugía cardiaca en niños, ya que cubre por completo el corazón e impiden acceder a él. Dado que las células Treg son producidas en el timo, este tejido constituye una fuente increíble de células Treg, no solo en términos de número de células disponibles, sino que también por su fenotipo indiferenciado y alta capacidad supresora.

Modificamos genéticamente las thyTreg para que expresen la proteína CAR. Gracias a estas CAR-thyTreg Ag-específicas, podremos desarrollar una terapia específica para cada enfermedad autoinmune o prevenir el rechazo en cada tipo de trasplante.

Para este desarrollo, a lo largo de los últimos años nos hemos enfrentado al desafío de conseguir modificar genéticamente estas células mediante la tecnología CAR, que las CAR-thyTreg generadas presenten una alta supervivencia, alta capacidad supresora y estabilidad de fenotipo, y, por último, que se puedan obtener grandes cantidades de estas células sin que estas manipulaciones afecten a su fenotipo o calidad.

Resultados de nuestro grupo demuestran que es posible purificar cantidades masivas de células Treg policlonales, del orden de 10×109 thyTreg a partir del timo de un único paciente. La terapia con células thyTreg autólogas podría permitir reducir la dosis de inmunosupresores y alcanzar la tolerancia a los órganos trasplantados.

Resultados

Hemos optimizado y puesto a punto todos los pasos que conlleva poder llegar a modificar correctamente una célula primaria, como son las thyTreg. Utilizando múltiples técnicas de biología molecular, y de manipulación génica, hemos creado varios tipos de CAR diferentes, cada uno con sus ventajas y desventajas.

En el contexto de la biología celular, hemos optimizado el protocolo a seguir para conseguir una adecuada expresión de estos CAR en células inmortalizadas de línea y con linfocitos T convencionales de sangre periférica, dada su facilidad en la obtención y en su manipulación. Una vez puesto a punto este paso con cada variante de CAR que tenemos, hemos empleado eficazmente el protocolo desarrollado en nuestro grupo para aislar las células ThyTreg de timos de pacientes pediátricos con patologías cardiacas. De igual forma, hemos optimizado las condiciones de cultivo adecuadas para la correcta transducción de las ThyTreg tras la purificación de estas.

Actualmente estamos llevando a cabo, ex vivo, los experimentos pertinentes para estudiar su estabilidad fenotípica y su funcionalidad tras la manipulación genética, con resultados muy prometedores. En breves, esperamos poder empezar los estudios pertinentes in vivo, que consolidarían el potencial terapéutico de esta inmunoterapia avanzada. 

Publicaciones

  • Comunicación oral en el 6th European Congress of Immunology, ECI 2021. Título de la comunicación: Avidin-based Universal CAR regulatory T cells (UniCAR-Tregs): a versatile approach for future immunotherapy.
  • Comunicaciones en la International Society for Cell and Gene Therapy 2021 Annual Meeting, ISCT2021 (formato póster). Título de las comunicaciones: i) Avidin-based Universal CAR regulatory T cells (UniCAR-Tregs): a versatile approach for future immunotherapy. II) TGF-β1 and IL-2 cytokines do not induce fully functional and stable regulatory T cells from activated thymocytes ex vivo.
  • Comunicaciones en el 42 Congreso Nacional de la Sociedad Española de Inmunología SEI2021 (presentación oral y formato póster). Título de las comunicaciones: I) Caracterización y funcionalidad de timocitos humanos modificados genéticamente para expresar Foxp3 mediante lentivectores. II) Las citoquinas TGF-β e IL-2 no son suficientemente eficaces para inducir in vitro linfocitos T reguladores con capacidad supresora a partir de timocitos activados.
  • Comunicación oral grabada en las Jornadas Intramurales 2021 del IiSGM. Título de la comunicación: Avidin-based Universal CAR regulatory T cells (UniCAR-Tregs): a versatile approach for future immunotherapy

Investigadores que participan

Investigadores colaboradores del IDIBAPS, Hospital Universitari CLÍNIC de Barcelona, Istituto Scientifico Romagnolo per lo Studio de la Cura del Tumori, Inserm, I.R.C.C.S. Ospedale San Raffaele y Cellnex.